一、样品采集与保存

采样时各位老师同学可以用小铲采集土壤，去除较大石粒后均匀混合成一份混合土样、装袋并尽快带回实验室。回到实验室后，尽快将土壤中的石头/植物根系/虫子等剔除，用2 mm筛网过筛后，置于4℃冰箱中保存, 并尽快冷链快递给我们（邮递地址：山东省济南市历城区电建路1188号山东省农科院院西B栋九楼农化房间）。如果短期保存（1个月内），将土壤置于-20 ℃保存，长期保存需将土壤置于-80 ℃冰箱保存。

二、不同实验需求送样要求

全套实验（田间持水量+微生物量碳+重氧水标记全实验）：≥30克土样。

仅重氧水标记实验：≥10克土样。

仅DNA提取和氧同位素测试：寄送重氧水标记的土样，土样量控制在0.45克以下。

仅DNA氧同位素测试：将提取好的DNA溶液置于小离心管，封口膜封好后，放入离心管盒中，冷链寄送给我们。

三、最大持水量测试和预培养流程

最大持水量WHC测试：取2 g左右鲜土至塞紧棉球的漏斗中，加去离子水浸泡2 h，用保鲜膜封口并去掉棉塞，让水分自由下渗12 h，测定土壤含水率，此含水率数据即为WHC。

含水率测试：取1 g左右鲜土至锡盒中，准确称量锡盒和鲜土的质量，放入烘箱105 ℃过夜烘干，直到质量不再变化，记录质量并进行含水率的计算。

预培养流程：取10-15 g左右鲜土，按照60%WHC进行水分的添加，放入25 ℃恒温培养箱中预培养7天。过程中需每隔两天取出称重，进行水分的补足。

四、微生物量碳MBC实验

称取4份预培养后的土样，每份3 g，其中2份置于真空干燥箱中用氯仿熏蒸24 h以上，另外2份不进行熏蒸。在熏蒸和未熏蒸的土壤中加入0.5M K2SO4溶液浸提（水土比4：1），在185 rpm振荡过夜，静置30 min后过0.45 μm滤膜，过滤液用TOC测试碳含量。 

五、18O-H2O重氧水标记实验

将预培养后的300-450 mg （以鲜土计）土壤置于2 mL冻存管里，将丰度为98%的重氧水用移液枪小心加入到冻存管中，以使土壤水中的18O丰度达到20%，同样于对照样中加入相同体积的去离子水。将加水后的冻存管在涡旋仪上轻轻混匀，打开螺帽，立即转移至30 mL培养瓶中，密封培养，每间隔6个培养瓶放置一个空白培养瓶。恒温培养箱25 ℃培养24 h后，用气密针从30 mL培养瓶抽取10mL气体用气相色谱仪（Thermo Trace GC Ultra）测定CO2浓度，并立即取出冻存管，盖上螺帽，放入液氮中迅速冷冻，再放入-20 ℃冰箱，一周内安排DNA提取。如没有办法及时提取DNA，需将冻存管放入-80 ℃冰箱保存。

六、DNA提取和氧同位素测试

采用土壤DNA试剂盒提取（MP Fast DNA SPIN Kit for Soil）土壤总DNA，再使用Thermo Qubit 3.0 Fluorometer核酸定量仪测试DNA浓度。

用移液枪移取30 μL DNA置于银杯中，于60 ℃烘箱中干燥6 h以上。用称量空银杯和烘干后的银杯质量之差来计算上机测试的样品质量，此参数用于DNA氧含量的计算。采用高温裂解-稳定同位素比率质谱仪（Thermo TC/EA- Delta V Plus）DNA中¹⁸O丰度。

七、微生物生长速率、呼吸速率和碳源利用效率计算公式

培养期间所产生的总DNA含量（μg）：

微生物生长速率（Growth，ng C g^-1 soil h^-1）的计算：

其中，DW为培养期间干土重，单位g，t为培养时间（h）。

微生物呼吸速率（Respiration，ng C g^-1 soil h^-1）的计算：

其中，p为大气压强（kPa），

n为C原子的相对原子质量（12.01 g mol^-1），

R为摩尔气体常数（8.314 J mol^-1 K^-1），

T是气体的绝对温度（295.15 K），

V为顶空瓶体积（L），

Rs为培养期间所产生CO₂的浓度（ppm）。

微生物CUE通过以下公式进行计算：

以上便是拜伦检测中心实验室整理的有关CUE测试相关的信息，有检测意向的老师同学，欢迎随时跟实验室的业务同事对接。

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